近日，浙江大學(xué)良渚實驗室王永成團隊、浙江大學(xué)生物信息學(xué)研究所樊龍江團隊、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院陳瑜團隊聯(lián)合M20 Genomics公司在Protein & Cell上發(fā)表題為High-throughput single-microbe RNA sequencing reveals adaptivestate heterogeneity and host-phage activity associations in human gutmicrobiome的研究論文。
該研究建立了基于隨機引物的高通量單細胞RNA測序技術(shù)及其數(shù)據(jù)分析方法，首次實現(xiàn)了復(fù)雜微生物組樣本的高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組測序與分析。
通過對人類腸道菌群單細胞轉(zhuǎn)錄組測序與分析，揭示了人類腸道菌群的異質(zhì)性結(jié)合針對性的計算分析方法，實現(xiàn)了復(fù)雜微生物群落中的微生物注釋和細菌-噬菌體轉(zhuǎn)錄活性分析，為人類微生物組研究提供新視角。
具體內(nèi)容
微生物組樣本的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序因樣本中菌群的復(fù)雜性和不同物種RNA的低捕獲效率，相對純培養(yǎng)樣本更為困難。
基于團隊之前開發(fā)的smRandom-seq(Xu et al.Nat Commun,2023)，通過優(yōu)化隨機引物設(shè)計和反應(yīng)體系，本研究開發(fā)的smRandom-seq2得以提高逆轉(zhuǎn)錄效率、細菌捕獲效率，并有效降低交叉污染(圖1)。
同時，研究開發(fā)了配套的生信分析方法和工具，用于分析測序得到的微生物組單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括單細菌注釋、細菌轉(zhuǎn)錄表達和噬菌體轉(zhuǎn)錄表達三個分析模塊。
通過上述生信分析方法，可以實現(xiàn)對每個微生物的準(zhǔn)確分類注釋，并可進一步開展細菌和宿主-噬菌體關(guān)聯(lián)分析。
本研究利用smRandom-seq2對健康人類的糞便樣本進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，共捕獲8,478個細胞，根據(jù)注釋結(jié)果共鑒定得到98種腸道微生物，其中15個屬的豐度高于1%，豐度最高的前5個屬分別為Prevotella、Phascolarctobacterium、Clostridium、Dorea和Roseburia。
根據(jù)腸道微生物的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)進行降維聚類，結(jié)果共劃分出11個細菌簇，屬于9個不同的細菌屬，包括Prevotella、Clostridium、Fusicatenibacter、Dorea、CAG-81、Roseburia、Phascolarctobacterium.Faecalibacterium和Lachnospira。
Prevotella屬和Roseburia屬分別納入了2個細菌簇，研究將這兩個屬的細菌簇進一步注釋到物種水平。
本研究進一步分析了2種Prevotella菌之間和3種Roseburia菌之間的差異表達基因(DEG)，發(fā)現(xiàn)同一個屬的不同菌種間存在適應(yīng)性反應(yīng)的功能異質(zhì)性，Phascolarctobacterium是腸道菌群中豐度最高的屬之一，而樣本中所有Phascolarctobacterium的細菌均屬于同一菌種:P,succinatutens。
為探索其是否存在種群內(nèi)異質(zhì)性，研究對其進行深入分析，聚類結(jié)果顯示存在3個主要細菌亞群并鑒定了這些亞群之間的DEG。
研究發(fā)現(xiàn)與可移動遺傳元件以及耐藥相關(guān)的基因，如ISClte1和mdtB等在亞群1中的表達水平顯著提高，基因表達共現(xiàn)分析顯示這些基因的表達之間存在顯著的共現(xiàn)關(guān)系，提示P.succinatutens的耐藥性可能來自該亞群同時，研究發(fā)現(xiàn)亞群2中琥珀酸途徑的相關(guān)基因，如mutB等存在顯著的高表達，提示該亞群通過琥珀酸進行化學(xué)能轉(zhuǎn)換的能力更高。
以上結(jié)果揭示了同一菌種在人類腸道中的功能異質(zhì)性，體現(xiàn)了其不同的適應(yīng)策略。
鑒于smRandom-seq2可以同時測定細菌及其中的噬菌體轉(zhuǎn)錄本，本研究建立了相應(yīng)生信分析工具(MIC-Phage)，在單個微生物水平上分析人類腸道菌群中宿主-噬菌體互作的轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)。
分類注釋結(jié)果顯示了人類腸道菌群中9個主要屬的噬菌體轉(zhuǎn)錄譜，噬菌體和細菌轉(zhuǎn)錄譜的聚類結(jié)果與9個主要細菌屬的匹配非常吻合，不同屬間噬菌體相關(guān)基因表達水平的顯著差異反映了噬菌體特異性感染的特征和能力。
研究選擇每個屬中轉(zhuǎn)錄活性最高的前20個噬菌體(共180個噬菌體)進一步分析，鑒定得到373種可靠的宿主-噬菌體關(guān)聯(lián)，其中至少有325種為新發(fā)現(xiàn)，體現(xiàn)smRandom-seq2在建立準(zhǔn)確的體內(nèi)宿主-噬菌體轉(zhuǎn)錄活性關(guān)聯(lián)方面的優(yōu)勢。
本研究開發(fā)的高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)smRandom-seq2，克服了以往技術(shù)的種種限制，能夠處理復(fù)雜的微生物群落樣本，可在單個細菌的分辨率上高效率、高靈敏地分析各種微生物菌群。
利用這一技術(shù)捕獲復(fù)雜微生物群落中細菌的功能異質(zhì)性，本研究揭示了人腸道菌群中細菌屬內(nèi)、種內(nèi)的適應(yīng)性策略異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個新的宿主-噬菌體轉(zhuǎn)錄活性關(guān)聯(lián)，開啟了人類微生物組研究的新方向！
作者信息：
浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院沈一飛副研究員、浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物信息學(xué)研究所博士生錢青宏、浙江大學(xué)良渚實驗室博士后丁利國、浙一醫(yī)院碩士生瞿聞馨、M20 Genomics張?zhí)煊詈退蚊系蠟楣餐谝蛔髡?，王永成研究員和樊龍江教授為共同通訊作者。
原文鏈接:https://doi.org/10.1093/procel/pwae027
本文轉(zhuǎn)載自公眾號“BioArt” / 澎湃新聞
原標(biāo)題:《【科技前沿】Protein & Cell|王永成/樊龍江團隊合作開發(fā)微生物組單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)》
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